细胞计数原理汇总

市场上细胞计数仪琳琅满目，那么这些细胞计数仪的方法和原理主要是哪些呢？

 1.手工显微镜法

 又称血球计数板法，是原始的细胞计数方法，显微镜下调整不同放大倍数的物镜，通过染色的方法人工观察细胞状态判断细胞死活，进行计数。通过检测出一定体积的均匀细胞悬液中的细胞个数（对一定数量的小格或中格计数，根据相应的小/中格所占的体积，可以推算出单位体积的溶液中微生物细胞的密度或总数），换算出每毫升的细胞个数，从而得到细胞悬液的细胞浓度。实验过程中采用五点取样法，即一般随计数室四角上的四个中方格以及正中间的一个中方格进行统计（对于压线的，采取数上不数下，数左不数右的原则）。这种方法数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，按照1个细胞计算。

图1、血球计数板             

2.库尔特原理

又称电阻抗检测原理。细胞是相对不良导体，当细胞悬浮电解质中，将小孔管插入细胞悬液，使其管内充满稀释液，位于小孔管两侧电极产生稳定电流。当一个细胞通过小孔时，瞬间引起电压变化出现一个脉冲信号，细胞体积越大，引起脉冲越大，产生脉冲振幅越高，脉冲信号由下列步骤完成：①放大；②阈值调节；③甄别；④计数。采用这种计数原理的仪器具有代表性的是CASY细胞计数仪，这种原理的仪器内置液路系统，需要定期清洗管路防止堵塞。

图2、电阻抗法细胞计数原理

3.图像法

通过高清摄像镜头获取高清的样品图片，根据活死细胞的形态、颜色，软件智能分析图片的结果。目前市场上采用这种方法的仪器大致分为两类，一类是明场细胞计数仪仅需简单的台盼蓝染色，另一类是荧光场细胞计数仪，需要相应的荧光染料。

（1）经典台盼蓝染色原理（明场细胞计数仪）：台盼蓝是细胞跨膜染料，活细胞膜结构完整，台盼蓝无法通过，细胞呈中心透亮具有明显的轮廓。死细胞膜通透性改变，台盼蓝可跨过死细胞膜进入细胞内，使细胞颜色加深，呈现实心的圆点与活细胞中心透亮轮廓清晰有明显的差异，根据这种形态的差异可以明显区别活细胞和死细胞进行区别计数。市场上明场细胞计数仪均是采用这种台盼蓝原理进行活死细胞计数。我们Countstar明场细胞计数仪一代需要外接电脑的Biotech和二代一体机Altair就是采用台盼蓝染色原理进行细胞计数。

图3、Countstar 明场细胞计数仪及检测结果

我们的明场细胞计数仪，无论是Biotech还是Altair均选取3个视野进行统计分析，检测视野的面积是血球计数板的6倍以上，这种高通量的样本采样量减少统计学误差，使检测结果更准确。另外，软件部分采用智能分析方法，分别圈出活细胞、死细胞、成团细胞，成团细胞根据检测的平均直径智能分割，确保聚团细胞检测的准确性。我们Counstar具有自主研发的“定焦”技术，无需手动调焦和自动定焦，保证样品检测结果的重复性和准确性。Tips：有部分使用者采用明场细胞计数仪时，直接用细胞原液上样进行细胞计数，没有使用台盼蓝染色，检测结果仅供简单的查看，没有实际的参考意义。

图4、Countstar明场细胞计数仪检测结果分析

（2）AO/PI荧光染色原理（荧光场细胞计数仪）：AO/PI为细胞核染料，AO为吖啶橙是一种小分子染料，可以跨过所有细胞膜进入细胞内，使有核细胞标记上绿色荧光。PI是碘化丙啶一种大分子染料，只有细胞死亡膜通透性改变后才能跨膜进入细胞内，使死细胞的核标记上红色荧光。AO/PI染细胞后，死细胞会同时染上AO和PI，AO的发射光波长532 nm左右，PI的激发光波长刚好与AO发射光波长相重，两种染料同染上死细胞核时会发生荧光共振能量转移（FRET），AO的发射光被PI吸收，所以死细胞只会显示红色荧光，而活细胞只有绿色荧光。因此，通过特异性染色的细胞上标记的红色荧光和绿色荧光就可以快速辨别出死细胞和活细胞。目前市场上荧光场细胞计数仪基本采用这种计数原理，这种计数方法的特异性染色可以排除无核细胞、杂质、碎片等的干扰，主要用于原代细胞、培养时间长后期发酵细胞、PBMC细胞（排除红细胞、血小板等无核细胞、杂质的干扰）等。下图是我们Countstar Rigel（全自动荧光细胞计数仪）产品通过AO/PI进行PBMC细胞计数的结果图。

图5、Countstar荧光场细胞计数仪AO/PI计数

4.流式细胞术

利用流式细胞术使单个细胞随着流体动力聚集的鞘流液在通过激光照射的检测区时，使光束发生折射、衍射和散射，散射光检测器接收后产生脉冲将光信号转换为电信号，脉冲大小与被照细胞的大小成正比，脉冲的数量代表了被照细胞的数量。流式细胞术需要用到较为昂贵的特异性荧光试剂和相应的激发光、滤波片，使用成本较高，因此基本不采用流式细胞进行细胞计数，而是进行细胞群分析。

5.结语

细胞计数是细胞相关试剂（抗体、疫苗、细胞治疗产品）的重要一环，检测结果的准确度、重现性、便利性、成本等是使用者重要的参考指标。目前成像法原理的细胞计数仪因其可以直观看到细胞形态以及软件分析前后结果对比的优势在其他计数原理的产品中脱颖而出，深受广大科研人员喜爱，下表是对上述原理分析的统计。